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应用转基因技术培育花卉新品种
（l：天津市园林绿化研究所 2:北京大学生命科学学院） |
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关键词：查尔酮合酶基因 仙客来 大岩桐 农杆菌介导法 原位生殖系统导人法 花粉管导人法 花色的形成与植物体内花色素的合成及液泡的PH值有关，所涉及到的有关基因很多，而在应用转基因技术进行定向改良花色的研究中用的最多也最成功的基因是：查尔酮合酶基因。为丰富我市花卉品种资源，改变现有花卉花色单一、品种缺乏的现状，我所和北大生命科学学院合作开展本项目的研究工作。 一、仙客来遗传转化的研究 （一）、材料和方法 l、材料 植物材料采用本所仙客来中心生产的“玫瑰红”、“杏红”和“纯白”商品花品种。菌株采用大肠杆菌DH5apBll2lchsA和DH5apWM10lchsA。 卡那霉素、细菌培养等生物试剂购自鼎国生物试剂公司，其它试剂均为国产分析纯。 2、方法 采用原位生殖系统导人法之花粉管导人法 进行遗传转化，直接将生殖细胞作为转化受体系统。 （1）、质粒的制备：从大肠杆菌DH5〆pBI121chsA 和DH5〆pWM101chsA中分别使用碱法提取质为pBll21chsA和 pWM10lchsA。使用 lx SSC 溶液溶解质粒。 （2）、亲本选择：选择株型好、叶色纯正、叶片花纹典型、花多、大而整齐的植株作为亲本。 ①、玫红：抗性强，后期生长快，成型效果好。要求冠径25cm以上，株型紧凑；花瓣鲜红色，喉部暗红色，花梗粗壮，花大，花数（包括显色蕾数）20以上，花蕾高出叶面 5－ 15cm；叶色绿，叶面平整，叶数20－30枚。 ②、杏红：株型低矮紧凑，生长速度均匀，成型早，抗性强。要求冠径25cm以上；花瓣圆形，杏红色，颜色鲜艳，喉部暗红色，花梗粗壮，花大，花数（包括显色蕾数）20以上，花蕾高出叶面5－15cm；叶色深绿，叶面平整，叶纹清晰，叶数20－30枚。 ③、纯白：株形低矮，成型快，抗性强，花梗直立，花朵整齐度好，栽培周期12－14个月。要求冠径25cm以上；花瓣白色，花大，花数（包括显色蕾数）20以上，花蕾高出叶面5－15 cm；叶片浅绿，叶面平整，叶纹清晰，叶柄短，叶数20－30枚。 （二）、遗传转化 1、去雄 当花蕾长至2．5－3。0cm时，将选做母本花的花瓣连同雄蕊从花蕾基部整个摘除，只留下花尊包被的雌蕊部分，等待授粉。 2、取粉 时间：晴天，从上午十点到下午两点。 3、授粉转化 将溶于 IX SSC溶液的质粒与相应的花粉混合调成糊状，涂于去雄的柱头上，套袋，隔天授l－3次，共设计了9个处理（见表1）。 （三）、结果 对于仙客来采用种质系统导人法自2001年12月一2002年3月进行了遗传转化，2002年夏天采收到种子4400余粒，关于座果及采种均值的统计结果（见表2）。 从表2可见，平均座果数以处理D最高，45。l％，G最低，为17．7％。平均座果率以F。D、E为高，大于 135粒，依次为 B、H、A，最低为C、G、1。平均单果采种数以D为高，35．7粒，F31．4粒，最低为C和l，7．2－4．5粒。综合比较，D、E、F三个处理在平均座果率、平均采种数和平均单果采种数均很高。 2002年10月22日将种子播种，223年3月11日统计发芽率，2003年4月15日统计上盆率，统计结果（见表3）。 从表3可见：总计平均发芽率为32．2％，总计平均存活率为82．0％，平均发芽率以F为高42．5％，E、C、D、H、B，介于38．3％－30．2％之间，G、1次之，最低为A。13。3％。上盆后统计存活率除A38．9％外，均高于70％。 对于仙客来采用原位生殖系统导人法——花粉管导人法自221年12月一2002年3月进行了遗传转化，2002年夏天采收到种子4400余粒，2002年 10月播种，上盆 1270株，存活千余盆。从生长发育情况看，转化植株生长普遍略慢，株型不如对照。显蕾后普遍生长很慢，比对照晚约一个月。有8株白花植株的个别花瓣出现了黄斑或略显黄色，3株白花植株的个别花瓣出现了桃红色条带（二乔），甚至整个花朵完全变成了桃红色。 （四）、转基因植株的分子检测 l、材料和方法 （1）、材料 供试材料采用改变花色的植株。植物总DNA提取及PCR反应试剂、Taq DNA聚合酶等生物试剂均购自鼎国生物公司。PCR反应引物购自联星生物试剂公司。 （2）、方法 ①、使用CTAB法提取植物总DNA ②、PCR扩增 引物： 以提取的总DNA为模板，以HPT为引物，进行PCR扩增，引物序列分别是： 5’端引物：5’ CCA CTA TCG GCG AGT ACT TCT 3’ 3’端引物：5’ CTC ACC GCG ACG TCT GTC GAG 3’ ③、PCR产物电泳检测 琼脂糖凝胶的浓度为0．8％。 2、结果 因为植物自身含有CHSA基因，可通过检测选择标记基因HPT，进而知道外源CHSA基因是否整合。将改变花色的植株提取植物总DNA，以HPT基因引物进行 PCR扩增，以阳性质粒为对照，其电泳检测结果见图1。从图可见，样品l、2和3在预期的约970hP的位置条带，说明外源基因已整合进去了。 二、大岩桐遗传转化的研究。 （一）、转化受体系统的建立 1、高效再生体系的建立 （l）、材料和方法 ①、材料：植物材料采用重瓣大岩桐；组培用试剂采用均使用国产分析纯；栽培基质采用经石和珍珠岩。 ②、方法：借助组织培养方式建立再生体系。 2、抗生素敏感性试验 （l）、材料和方法 ①、植物材料： 大岩桐组培苗的叶片和茎段。 ②、试剂：卡那霉素等生物试剂和耗材购自鼎国生物公司和联星生物试剂公司，组培用试剂均为国产分析纯。 ③、方法：采用对比实验法。将大岩桐组培苗的叶片和茎段放入附加有不同浓度K+的分化、继代及生根培养基上培养（必要时，转苗l－2次），经过一段时间后统计结果。 （2）、结果 通过实验我们发现，大岩桐耐受卡那霉素的浓度很高，尤其是茎段在K+400mg/1时，还有的一些能存活。而茎段在生根培养阶段对卡那霉素较敏感，超过可耐临界浓度即不生根，叶片的筛选浓度也用到了250－30Omg／l。 （二）、遗传转化的研究 对于大岩桐采用农杆菌介导方法进行遗传转化。 l、遗传转化 （1）、材料和方法 ①、材料 菌株采用根癌农杆菌 Agrobacteriea tumefaxiens LBA4404 pBll21ChsA；植物材料采用大岩桐组培苗；卡那霉素购自鼎国生物公司和联星生物试剂公司，培养农杆菌的生物试剂等均购自鼎国生物公司。组培用试剂均为国产分析纯。 ②、方法 采用叶盘法进行侵染。 1）、农杆菌LBA4404 pBI12lChSA的培养： 取10mlLB液体培养基，加人抗生素——卡那霉素和利福平，使其终浓度为K+ 100mg／l，Rif+80mg／L。从新鲜平板中挑取单菌落加人其中，摇匀（如必要，可旋涡混匀），于28℃，180rpm过夜培养至对数期。 将菌液用LB液体培养基或1／2MS稀释10倍左右，再摇约4小时，备用。 (2）、共培： 将摇好的菌种再稀释3－4倍，至菌液略显混即可，备用。 取大岩桐组培苗中、上部的叶片，沿叶缘剪 一圈，大叶脉处划一道儿。置于菌液中浸3分钟左右。 取出叶片，在无菌滤纸上吸干多余的菌液， 叶背朝上置于纯MS培养基上，培养3－5天。 (3）、脱菌筛选： 将叶片从共培培养基中取出，放人无菌水中浸洗（如菌生长过多，可在无菌水中加人拔节或隆抱），用滤纸吸干。 然后转人抗性直接分化培养基上，进行脱菌与筛选培养。 a．MS十 BAI＋NAAO.l十 LH200十 K+ 300mg／1＋Carb+（或Cef+ ）500mg／l。 抗性芽的扩繁与继代培养： 将a上再生的大于1cm的卡那霉素抗性芽切下转置抗性继代培养基b和C上。 b．MS＋BAO.5 ＋NAAO.l＋ LH200＋K+ 300mg／1＋Carb+（或Cef+）250mg/l c．MS＋BAO．3＋IBA1.5＋ K+ 300mg／l＋ Carb+（或Cef＋）25Omg／l 4）、将在抗性继代培养基b和C上长至2－ 3cm的植株再继代（Carb”或Cef十减半）。 还可将抗性继代培养基上长出的大苗的叶 片反接于抗性分化培养基上（抑菌抗生素适当 逐减），促其分化，再扩繁和继代。 5）、抗性株的生根筛选： 将抗性继代培养基b和c上长至2－3cm 的植株移人抗性生根培养基h或E上，做生根与筛选。 E· MS＋ K+300mgll＋ Carb+（或 Cef＋）125mgll； F：l／2 MS＋ IBAO． 2＋ K+300mgll＋ Carb+（或Cef＋）125m／l 6）、出苗移栽： 将在加有抗生素的生根培养基上生根的苗在常温下放置3天，再在移栽温室开盖炼苗3天。将炼过的苗从瓶中取出，洗去琼脂，栽人6：4的蛙石／珍珠岩混合基质中，用0．l％的高锰酸钾浇透，遮荫养护。 （2）结果 ①、抗性芽的分化 采用叶盘法对大岩桐的叶片侵染后，直接放人脱菌筛选培养基中进行立即选择，20多天后开始在个别叶的叶柄等处长出不定芽，继续培养不定芽可长大。而对照叶片未有不定芽长出。 ②、抗性芽的扩繁 大于1cm的卡那霉素抗性芽均可成功地进行继代与增殖培养。 ③、抗性植株的生根与筛选 将生长至2－3cm的植株移人抗性生根培养基进行生根与筛选，多数转化植株生根正常，少数不能生根从而做为假转化体被排除。 ④。出苗移栽 炼过的苗移栽后，成活率明显低于未做基 因导人的植株。 2、转基因植株的分子检测 (1）、材料和方法 ①、材料 供试材料采用抗卡那霉素的大岩桐阳性转化植株。植物总DNA提取及PCR反应试剂 Taq DNA聚合酶等生物试剂均购自鼎国生物么司。PCR反应引物购自联星生物试剂公司。 ②、方法 1）、使用CTAB法提取植物总DNA。 2）、PCR扩增： 引物： 以提取的总DNA为模板，以NPTI为引物，进行PCR扩增，引物序列分别是： 5’端引物：5’－ AGGCT ATTCG GCTAT GACTG G— 3’ 3’端引物：5’－ GCGGT CCGCC ACACCCAGCC G—3’ C、PCR产物电泳检测： 琼脂糖凝胶的浓度为0、8％。 （2）、结果 转基因植株的PCR检测： 因为植物自身含有CHSA基因，可通过检测选择标记基因 Ngrll，进而知道外源 CHSA基因是否整合。将经过多次筛选的植株提取植物总DNA，以NPTI基因引物进行PCR扩增，以阳性质粒为对照，其电泳检测结果见图2。从图可见，样品1、2和3在预期的约600hP的位置有条带，说明外源基因已整合进去了。 三、结论 本项目以仙客来、大岩桐做为研究对象，以查尔酮合酶基因（CHSA）为目的基因，经过四年研究，取得了阶段性的成果，并得出以下结论。 1、成功地进行了控制花色相关基因——查尔酮合酶基因的克隆、分离与筛选，并构建了植物基因工程载体：大肠杆菌DH5〆pBI121chsA、DH5〆pWM101chsA和农杆菌 LBA4404pSI121chsA. 2、在国内，我们首次采用原位生殖系统导人法——花粉管导人法对仙客来进行了遗传转化，成功地得到了仙客来转化种子4400余粒。种子播种后，其中8株白花植株的花瓣出现了黄斑或略显黄色，个别花瓣变成了黄色花瓣；3株白花植株的个别花瓣出现了桃红色条带（二乔），甚至整个花朵完全变成了桃红色。 3、我们首次采用土壤农杆菌介导法对大岩桐进行了遗传转化，成功地得到了大岩桐转化植株388株，其中8个株系的转基因植株经PCR检测呈阳性。 参考文献： [1]、《植物基因工程原理与技术》王关林 等 主编 科学出版社1998．6 「2」、《植物基因与分子操作》顾红雅 瞿礼佳 等 编著 北京大学出版社1997．5 [3]、《植物遗传转化技术手册》傅荣昭 等 主编 中国科学技术出版社1994．12 [4]、《农业生物工程》莽克强 主编 化学工业出版社 1998． 11 「5」、《精编分子生物学实验指南》颜子颖 王海林 译科学出版社1999 ［6］、《分子克隆实验指南》金冬雁 黎孟枫 等 译科学出版社1999 [7]、《分子遗传学》孙乃恩 孙东旭 朱德煦 编著 南京大学出版社2000．4 [8]、《分子生物学》严隆飞 张玉麟 主编 中国农业大学出版社1999．6 「9」、《查尔酮合酶基因对转基因植物花色的影响》邵金莉 李毅 等 ［10］。《转查尔酮合酶基因矮牵牛共抑制的研究》北大生命科学院2001界 博士毕业生李雁 毕业论文 ［11］《植物组织培养教程》李浚明 编译 中国农业大学出版社2000．9 ［12］、《观赏植物组织培养技术》谭文澄 戴策刚 主编 中国林业出版社1999．7
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