金边瑞香离休诱变及抗寒变异体选择


陈香波1罗玉兰1李团锦1金亚芳2

（l、上海市园林科学研究所  2O0232  2、上海市农业科学院 201 106）


   摘要：对金边瑞香组培苗实施”CO－Y辐射物理诱变，确立适宜的辐射剂量为7Gy；－20℃处理1小时离体筛选条件下，获得少数耐 低温变异体，有待进一步大田鉴定。
   诱变育种是指利用各种物理的（x射线、Y 射线）及化学的处理方法实现遗传物质变异，选择培育新品种的方法。一直以来，观赏植物被认为是实施诱变育种的理想材料，首先观赏植物育种所期望的变异类型多是一些感官性状变异，如花色、叶色、花型等，容易受诱变操纵处理获得；其次，多数观赏植物都是遗传异质体即杂合体，行无性繁殖，诱变当代（M1代）即可选择、固定变异体，进而繁殖扩大，育种周期缩短。此，近50年间观赏植物的诱变育种取得快速发展，得到大量突变新品种。据1998年的统计数据（Sebum  and Preil 1998），人们已在41种观赏植物中诱变获得600多个园艺品种，包括鸯尾属、秋海棠属。菊属、大就属、九重葛属、锦带属、连翘属等众多球根、切花类以及乔、灌木植物等，其中切花类育成358个品种，以菊花最多（16个品种）。诱变育种的发展经历了早期的植株整体或器官的诱变到以组织、细胞甚至原生质体为诱变材料，并结合组织培养的离休诱变。直至近年发展起来的体细胞无性系变异等几个阶段。离体诱变技术大大发展了常规诱变育种，并使育种效率得到很大的提高，原因是：l、利用离体培养技术可以有效的分离突变组织或细胞；2、不受时间、空间的限制，可以在有限的空间处理大量材料，筛选后变异体立即可以扩繁；3、经由不定芽发生或体细胞胚状体再生，可以得到单个细胞起源的同质变异体，避免了嵌合体的发生等。

诱变技术在观赏植物中应用，性状变异可以是花部性状（花色、花的大小、形状及香味）。叶部性状（叶形、叶色、叶的大小）及一些生长习性（紧密度、攀缘性、分枝性等），另外还有生理性状（花、丰花、抗逆性）等，前三类都是直观形态或  官类的变异，直接观察（感觉）就可区分，而生性状尤其是胁迫抗性，如抗寒、抗热、抗旱、抗Z  抗病性变异等则较为复杂，需要一定的培养条  筛选变异体。有关抗寒离体诱变，已在崖柏店  大裁属、菊属以及劳尾属等观赏植物中获得过耐低温变异体。德国学者W．Preil等通过X射线诱变菊花（ Chrysanthemum morifolium  cv．‘ Parlia．ment’）悬浮培养细胞得到在低温下开花的突变体。北京林业大学用60CO－Y射线处理‘药红’小菊脚芽小叶愈伤组织，经选择培育获得抗寒抗旱、耐盐碱、开花时间长的突变体；林定波等以柑桔（ Citrus sitensis  0sb．Jinchen）悬浮细胞为对象，经两次低剂量Y射线照射及高羟脯氨酸（HYP）选择，得到一抗寒细胞系并再生成株。作物中，Thinh（1990）报道采用Y射线辐照甘薯五管苗并结合单茎节离体培养，获得了耐低温变异材料。抗热性方面，黄剑华等以60Co－Y射线用射青菜种子结合茎尖诱导、高温筛选获得青菜而热变异体。可见植物的温度耐受性（耐寒、耐热性）是可以通过诱变的方式加以改变的，从而获得稳定的突变性状而获得有价值的新个体，这对那些因为有用（抗寒、耐热）种质缺乏而无法通过常规育种改变温度耐受性的植物来说，将是一条可供选择的育种新途径。

    开展植物离体诱变育种，需要进行四个方面的研究：l、完整的组培再生体系研究，包括不定芽诱导、增殖、生根成苗等，细胞水平诱变程序则包括诱导细胞脱分化、悬浮培养、分化成苗等；2、适宜的诱变剂量（物理诱变）或浓度（化学诱变）的确定；3、突变体的分离筛选；4、植株成苗后进一步鉴定其获得变异性状的稳定性。

金边瑞香（D． odora Thunb。Cv Aureomar－ginata．）为瑞香科（ Thymelaeaceae）瑞香属（Dophne）常绿灌木，为瑞香的一个变种。原产我国，分布在长江以南各省区，观赏价值很高，是我国稀少的名贵花卉之一，北方地区室外越冬会因零下低温而受冻害，因而抗寒性成为金边瑞香首先需要改良的性状。金边瑞香花开后即脱落，较难收获种子，常规育种很难实现性状改良尤其是抗寒力提高，因此我们尝试应用CO－Y照射处理金边瑞香组培茎芽，对其实施离体诱变并做耐寒性筛选，初步研究结果如下。

    一、材料与方法

    剪取金边瑞香花序基部抽出的幼茎带回室内，滴2－3滴洗洁精，加水摇动振荡10 min，流动自来水冲洗 3Omin， 0.l％升汞溶液消毒2min，无菌水冲洗3遍，接种在XI培养基（MS＋ 6－ BA 0.5mg． L－1＋ NAA 0.2 mg．L－1）进行初代培养，4O天后转接诱导产生的丛生芽至X2培养基（ MS＋ 6－ BA 0.5 mg． L-1），继代增殖产生大量组培茎芽。培养基均加 0． 5％琼脂和3％蔗糖， pH值 5．8，培养温度25.2℃。

采用60CO－Y射线对在X2培养基上接种9天的茎芽（无根苗，株高1．5cm上下）进行辐射诱变处理，剂量分别为2Gy、4Gy、6Gy、8G、10Gy，剂量率1Gy／min，0Gy为对照，照射后置于温度 2512℃、光照强度 1000－ 2O00lX，每日光照16小时的光照培养箱中培养，每处理3瓶，每瓶接种6株，辐照前称量每瓶苗鲜重，40天后再次称量苗重，统计成活率、株高及单株分化芽数。计算茎芽生长量以相对增重表示：                     

(W  -Wo)

    相对增重（％）=_____________×100              

                 〔CK－CKo〕／CKo

    W——处理辐照40天后苗平均鲜重

    W。——处理辐照前苗平均鲜重

    CK——对照辐照4O大后苗平均鲜重

    CK。——对照辐照前苗平均鲜重

    二、结果与分析

    l、金边瑞香Y射线辐射敏感性

    用OGy－10Gyy射线对金边瑞香组培茎芽进行辐照处理，结果列于表1、表2，图1直观反映了辐射抑制茎芽生长的效应，茎芽相对增重随辐射剂量的增大逐渐减少，在6 cy时，生长量只有对照的 55． 6％，上升到 8 Gy，则生长量降至对照的37．8％，由此可推断金边瑞香的组培茎芽半抑制剂量LDSO应该在7 Gy上下。                                       

    60CO－Y射线明显抑制金边瑞香组培茎芽的高生长，剂量在10 Gy时株高仅有对照的60％。茎芽分化受影响不大，保持在每株分3个不定芽以上。在0－10 Gy范围内随着剂量的增大，茎芽存活率下降，伤害逐级加重，表现为顶部小叶变褐枯焦、茎尖成黑点，茎基部颜色由淡灰褐色加深成黑褐色，并由下至上扩展至整个茎段，伴随叶片脱落，整株死亡。

    2、Y射线诱变效应

低剂量Y射线（＜10Gy＝照射，会出现因顶芽受损而从顶芽周围分出多个小芽的现象，其中4Gy剂量下出现2株、6Gy出现13株、8Gy10株，分别占该剂量下处理总株数的 11％。72％和56％，枝顶分化芽数为2－4个。而这些分化的芽出现明显的叶变态，叶形呈耳状、马蹄形等，有的芽伸出的茎顶只带一片叶等，所有这些变化都说明Y射线60CO照射对金边瑞香组培茎芽具有诱变效应。

    3、离休耐寒变异体筛选

基于以上金边瑞香组织培养及辐射敏感性研究结果，我们进行了大批量金边瑞香组培茎芽的Y射线辐射诱变工作，辐射剂量8 Gy、剂量率  IGy／min，接种及培养方法同前述处理。4O天后保留上部存活茎段继续转接至X2培养基，促使生长并诱导不定芽分化，50天后切单芽（包括顶芽、侧芽及不定芽）二次转接至X3培养基（ MS＋ 6－ BA 0．2mg．  L－1），由此每芽在以后的继代分化中成为一个芽系，芽系内不同芽均属无性繁殖的后代，不进行选择，而考虑进行芽系间选择，受辐射诱变因素影响则出现变异的可能性会相对大。因此，每芽系保留一株做离休耐寒变异体的筛选，其余株使成苗移栽，继续观察比较一些形态变异（叶形、叶色、株型及花部变异等）。

    经实验初步确定离体筛选条件，先将组培茎芽放置4℃弱光条件下（光照强度500k）抗寒锻炼两周，－20℃处理互小时取出，常温恢复12小时后放回光照培养箱，对照苗基本全部茎、叶呈水浸状后转黄，整株受冻死亡，而有个别存活株局部叶有留存并且保持绿色，是否为耐寒变异体还需做进一步大田鉴定。

    三、结论与讨论

    l、进行植物辐射诱变时，辐照剂量随辐照材料选用的不同而有很大差别，反应了不同的辐射敏感性。组培苗本身较大田苗幼嫩，适宜辐射剂量应有所降低。从本实验来看，金边瑞香组培茎芽进行Y射线60CO照射的剂量应控制在 SGy以下，超过 10 Gy则茎芽不能存活，与菊花组培芽点的 10－30 Gy适宜剂量相比明显偏低。

    2、后代变异性状的选择应根据性状特点区分选择，如对花部、叶部、枝条等的感官、形态变异可先使成苗后移栽大田观察选择，而生理性状的变异（比如抗寒性）则必须结合一定胁迫处理加以选择。选择又分离体选择及成苗后选择等途径，目前两种观点还存在争论，但不论离休时期选择与否，最终只有经过田间实际种植评价才能最终得出是否获得的是稳定的变异体，必要时还需结合自交、回交等常规手段分析其遗传规律及性状变异的稳定性。