草坪草转基因研究的现状和前景
柴明良
(浙江大学园艺系 310029)
自上世纪70年代末期发现土壤中的农杆菌可将自身的一段可转移的DNA片段自然地插入双子叶植物细胞的染色体内、并表达出致肿瘤性状后，双子叶植物的基因工程技术发展迅速。上世纪80年代，随着单子叶植物原生质体培养技术的进展和商品性的基因枪的出现，禾本科的粮食作物，如水稻、大麦、小麦等的转基因也相继获得成功。随后，转基因草的研究也引起了有关科学家的重视。1988年获得了第一例转基因草高羊茅，1992年得到了首例转基因的草坪草高羊茅，标志着转基因技术在草坪草上应用的开始。
通过自然选择、杂交和人工诱变等传统的育种手段，在1946年至1996的50年间，美国就有245个注册登记的草坪草品种。不同来源的信息表明，美国现有高尔夫球场14000到17000个，运动场40000个，庭园草坪、公园草坪和停车场草坪则多达4000万个。草坪草的重要性也反映在草坪种子的规模上。上世纪90年代中期美国仅草坪种子年销售额一项就在5.8亿美元到12亿美元间。如果再加上与草坪业相关联的草坪机械、草坪肥料和农药等，草坪业在美国已经是一个庞大的产业。其它发达的国家，英国、日本等，草坪业也占有相当重要的地位，如日本的高尔夫球场就达2500个。从上世纪80年代开始，随着我国经济的快速发展，草坪业也占有相当重要的地位，如日本的高尔夫球场就达2500个。从上世纪80年代开始，随着我国经济的快速发展，草坪业也蓬勃兴起，从上世纪90年代初，每年进口草坪种子在1000吨左右的规模发展到现在的约年进口7000吨。彩无性繁殖的草皮生产，更是难于统计。虽然草坪的经营、管理和生产在农业领域是增长最快的领域之一，但是草坪草的遗传转化（转基因）却落后于其它许多重要的作物种类。虽然传统的植物育种技术能够将单个或多个耐逆性状和农业性状整合到新品种中，但是传统的育种受到生物隔离的限制，同时进展缓慢、耗时，甚至不可能。转基因技术提供了一种新的、有效的、革命性的手段，它不仅仅可将单个性状，也可以将复合的多重的生物学和非生物学的耐逆性状整合进去，而采用传统育种要达到上述目的非常困难，甚至是不可能的。
草坪草只用于环境的绿化，与作为人类食用或动物饲养的植物种类相比，不存在食用的安全性，故转基因草坪草的局限性要小，前景更大。既然如此，为什么草坪草的转基因却落后于大豆、棉花、番茄等双子叶植物，也落后于水稻、小麦、大麦等同类的单子叶植物呢?笔者认为，除了草坪草重要性不如国计民生的水稻和日常消费所不可缺少的蔬菜等种类外，非常重要的一点是草坪草组织培养再生的难度和繁殖体系限制了其研究的进展。
除了极少数非常容易转基因的物种，如烟草、牵牛花等植物可以活体转化，可用带目标基因的农杆菌与花粉混合后授粉就有可能获得转基因的后代外，极大多数的植物，包括草坪草，要通过离体的组织培养过程来实施转基因。草坪草属单子叶植物，通常比双子叶植物的组织培养再生要困难，总体上讲也比同属于单子叶的水 稻、玉米、大麦等要困难。目前适合于草坪草转基因的组织是胚性愈伤组织和茎尖等衍生的分生组织。通过种子获得这两种组织现在已基本建立，但相当一部分种类的效率仍然不高；而通过无性繁殖的器官，如匍匐茎等来获得这些再生组织非常困难，目前只有极个别成功的报道；通过未成熟胚和花序也有相当的难度。许多草坪草品种是通过无性繁殖来保持其优良的性状的，用种子为材料获得的转基因草难于直接应用，况且这些品种也不结种子。还有一些草坪草种类虽然是种子繁殖的，但其商品品种是由几个无性系混合而成，只有同时将其每个成员都转化成功，才能保持转基因性状外其余性状与原品种的一致性。而要达到这一点，更不是一件容易的事情。
至今为止，有三类转基因方法用于草坪草的转基因研究。它们是原生质体DNA吸收法、微粒子轰炸法(通常称为基因枪法)和农杆菌介导的转化法。
原生质体DNA法是指首先从草的种子或从茎等无性器官诱导具有较高再生能力的胚性愈伤组
织，然后对愈伤组织进行液体悬浮培养，再用纤维素酶、果胶酶等处理获得原生质体。原生质体与带有目标基因的质粒DNA以及促进转化的化学物质，如聚乙二醇或碳化硅纤维混合，并辅助于电穿孔技术，将外源DNA引入原生质体。最后在原生质体的生长过程中选择出转化的细胞并再生植株。此法由于单子叶植物原生质体固有的低再生能力，所以技术要求高，也容易产生体细胞变异，并且插入的基
因拷贝数量多，影响转化植株的稳定性。从时间顺序讲，1998年以前公开发表的草坪草转化的论文，几乎都采用这种方法。
基因枪法是指将带有目标基因的质粒DNA涂在直径1-4微米的金粒或钨粒的表面，通过高速气体的驱动，直接将外源DNA射入胚性愈伤组织或悬浮细胞的染色体内，然后是选择和再生。其主要优点是非特异性，从理论上讲适用于任何的植物种类，但是设备价格昂贵，也有类似于原生质体法的缺点。1998年后公开发表这方面的论文，目前应用较多。
农杆菌介导法是指首先将带目标基因的DNA片段接入质粒载体的T-DNA区域内，然后将此质粒引入农杆菌。农杆菌侵染植物材料，自然地将基因片段引入植物细胞。此法价格相对便宜，转化效率较高，最重要的优点通常是引入完整的基因，且外源基因的拷贝数少，子代较稳定遗传，是目前植物转基因最流行的方法。但由于草坪草属单子叶植物，不属于农杆菌天然的寄主，以前一直没有成功的报道。直到2000年，包括笔者在内的两个研究小组在草坪草上获得成功。目标材料为翦股颖和结缕草。
统计到2002年5月中旬，在美国农业部进行转基因草坪草风险评价的草坪草种有；匍匐翦股颖、狗牙根、高羊茅、草地早熟禾、多年生黑麦草、钝叶草和velvet翦股颖。最为成熟的是匍匐翦股颖，表现为项(次)最多，达到114项(次)；其次为草地早熟禾为24项(次)；再为高羊茅，10项(次)；狗牙根第四，8项(次)；多年生黑麦草和钝叶草各为3项(次)；velvet翦股颖最少，仅一项。引入的外源基因，除报道基因和标记基因外，有经济价值的基因主要有耐除草剂的基因、耐干旱的基因、增强耐盐性的基因；抗真菌病害，如币斑病、褐斑病的基因；改变生长速度的基因；耐热的基因；抗虫的基因；耐铝的基因等等。在草坪草转基因上表现最为突出的大学和研究所为Rutgers大学、Scotts研究所及Monsanto公司，如狗牙根8个项(次)全部是Rutgers大学的成果，在匍匐翦股颖中也占了将近1/3。近几年来，我国大陆也有一些科研院所开展了草坪草的转基因研究，如中国水稻研究所、北京大学、北京林业大学、华南农业大学以及笔者所在的浙江大学等等。在美国从事草坪草转基因研究的学者中，有相当一部分也是华人。
前面已经提到，草坪草原则上讲不作为动物的饲料，也就不会给人畜带来食用安全性的问题，故目前最关心的问题是转基因的扩散问题。美国在匍匐翦股颖已做了详细的研究。他们的杂交试验证实，转基因的匍匐翦股颖可通过花粉将抗耐草剂的基因扩大散到同属的A.canina、A.capillaries、A.castellana、A.gigantean、A.pallens等种类中去，这是一种潜在的风险。为了防止花粉扩散，可以采用终至花粉发育的雄性不育机理、将目标基因转移到叶绿体中来确保转基因只通过母性传递、将转基因的植物种在不含与其杂交亲和种类的环境中等措施。随着分子生物学研究的进展，也已经发明了诸如功能的可恢复性阻碍、胚发育停滞、种子发芽停滞等可控制转基因扩散的技术。另外，能够提高转基因性状表达能力和表达稳定性、控制整个代谢过程的大片段的ＤＮＡ转入植物体也已经成为可能。总之，包括转基因在内的植物生物技术的前景是光明的、无限的。不久的将来一定会在发达的国家获得适应多种逆境的转基因草坪草。我国园林研究工作者，应该加强与美国等发达国家的合作，尤其与华人科学家的合作，尽快在这个领域有所作为。