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通过烟草光敏色素BI基因的异位表达改变菊花的植株结构
柴明良 译 |
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控制植株高度是许多重要园艺作物生产过程中要考虑的一个主要因子。通过遗传途径或栽培技术措施降低高度通常可为生产者提供经济利益。表现为短茎的许多作物的栽培品种通常具有较高的收获指数。其生理基础是同化产物的重新分配，造成可收获单元梢生物量积累比例的增加，从而提高产量（Loomis和Conner1992）。在蔬菜等一些作物中，控制茎的过度伸长也是防止倒伏所必需的（ Garner和 Bjork－man，1996）。此外，较短的茎增加花卉和其它温室生长作物的质量和价值。因此，对生产者而言，控制株高是一种经济的需求（Gianfagna，1995）。 可以采用若干方法控制温室作物的高度。最常用的方法是采用化学生长调节剂（Dole和Wilkins，1999）。许多商品性的生长延缓剂，通过抑制赤霉素的生物合成，从而降低一种或多种生物活性赤霉素的内源含量，达到减少茎生长的目的（Gianfagna，1995）。但是，这种方法要生产者投人大量的化学药剂和劳动力。并且，在许多国家，用于控制株高的合成的化学生长调节剂不准用在最终为人类消费的作物种类上。 也可采用栽培措施控制温室作物的高度。例如，通过维持夜温高干日温（DIF）的日常温室热周期，是在许多作物上替代化学生长调节剂的一种有效栽培方法（Dole和 Wilkins，1999）。但是，负的DIF不能够在某些地理区域或一年中的某些时间采用。当温室中的夜温高于日温不可行或有害于植株生长时（Dole和Wilkins，1999），对植株进行机械刺激（涂刷或阻抗）也可限制不良的茎的伸长，但是实施这一方法控制高度通常在经济意义上不实用（Gar－ner和 Bjorkman，1996）。控制许多温室作物节间过度生长的一种有希望的新方法是采用光选择性过滤器，选择性减少70O－8O0nm波长的远红光（ McMahon Kelly， 1995；Rafonakse等，1999）。 控制茎生长的第三种途径是通过传统育种技术培育个体矮小的栽培品种（Loomis和Con－ner，1992）。虽然这种方法比采用栽培技术措或采用生长调节剂减少了生产者的经济投入，但是培育矮茎的栽培品种过程缓慢，费用高。因而，控制植株高度的育种主要用于农作物。 生物技术提供了一种替代传统育种的吸引的途径，对干单基因控制的性状可以很快地整合到已有的品种中去，从而大大地减少培育新品种的时间和费用。光敏色素基因的遗传工程为控制无性生长和生殖发育提供了一种潜在的途径（Robson和Smith 1997）。一个PHYA基因在烟草和马铃薯中的异位表达，通过对远红光（FR）的超过敏性，显著地控制了茎的伸长和增加了收获指数（Robson等，1996）。同样地，拟南芥或水稻PHYB基因在拟南芥中的异位表达，导致了光生长（light－grown）实生苗的伸展生长（extensio growth）（McCormac等，1993； Wagner等， 1991）。此外，拟南芥 PHYB基因在烟草和马铃薯中的异位表达也抑制了成熟植株茎的伸长（ Halliday等，1997 Thiele等，1999）。 最近，一个烟草HLG位点编码的类PHYB光敏色素已显示出为红光（R）的一个感受子，而不是红光与远红光的比例（R／FR），似在拟南芥、油菜和黄瓜中的PHYB那样（Hudson等，1997；Smith和Whitelam，1997）。在big突变子中，对低 R／FR的响应并没有减弱，但是对红光的影响起了变化（Hudson等，1997）。HIG编码的 PHYB与烟草中的 PHY— BI享有 97％的同源性（Adam等，1997）。因为在许多作物中，富含红光波长的光抑制茎的伸长（Smith1994），所以我们假设烟草PHY—BI基因的异位表达将增加对红光的敏感性，从而抑制茎伸长。故本研究的主要目的是以菊花为目标种类进行转化来验证这一假说。 材料和方法 植物材料和生长条件：从 Yoder Brothers有限公司（Pendleton，S．C．）获得“lridon”菊花生根的茎插穗，维持在温室中作为母株。试验用的植株通过无性繁殖而得。植株施肥用完全肥料（20N－8．6P－16．6K），氮的浓度为20Omg／l（Scotts－Sierra园艺产品有限公司，Marysville，俄亥俄州），每周三次。无性繁殖母 株顶茎插条的近端部分（ Proximal Portions o1 terminal stemcutting）用 lmg／INAA蘸，然后栽在含商品无土基质（ Metro— Mix360； Scotts－sierra园艺产品有限公司，Marysvile，俄亥俄州）的500ml大小的盆中。长成的植株在温室中栽培，温度调节到25℃，自然的光周期延长到17小时的长日照（LD），用I000W高压钠蒸汽灯加光（80到 100umol．M-2s-1光合作用活性照射（PAR）。从6—10点和16—23点。通过覆盖达到短日条件（LD）。每日在16：30一次日8：30，用黑色阴影布覆盖。 35s：： Nt— PHY— BI的结构： Nt— PHY一BI cDNA全长的 4kb BamHI／Clal片段（Kern等，1993）进行平端化，然后正义取向连结到pJITll7D2载体Smal位点。表达载体含有花椰菜花叶病毒（CaMV）355启动子和 Poly A终止子序列，以及减去靶叶绿体多肽序列的双重促进子序列（Guerineau等，1988）。所建成的pJB用 KPnl切割，含 Nt－PHY—BI cDNA。35s启动子和终止子的 5．5kb Kpnl片段，亚克隆到二元载体pBIN19的Kpnl位点。然后，采用冻融法（An等，1993），将所形成的质粒pESB转移到根瘤农杆菌超致病力菌株EHA105中。 植物转化：在含 0．5mg／1BA和 1．omg／INAA的 MS培养基（An等， 1993）上，从叶盘和幼嫩的节间片段再生植株。植物转化的程序改良干Sherman等（1998）。带pESB的农杆菌细胞在含 50mg／l卡那霉素和 25mg／1利福霉素的 2O0ml YEP液体培养基（An等，1993）中培养。两天后，当在6O0nm下光密度约为2时，此培养物在40009n下离心5分钟，然后沉淀，用 10ml无菌 MS培养基再悬浮。叶盘（1cm2）浸入此农杆菌悬浮液中5分钟，然后置于不含抗生素的再生培养基中培养3天，再将叶盘转入到含50mg／l骏书青霉素的再生培养基中。在4—5周内再生了假定抗卡那霉素的梢。将上述梢切下后转入含 0．lmg／INAA，以及含与梢再生培养基中相同浓度的卡那霉素和按千青霉素的MS培养基中。约3周后，带充分发育根系的植株栽入盆中，移入前述的温室。 PCR和RNA印迹分析：用PCR扩增烟草 PHY—BI cDNA用于鉴定假定转基因的植株.从抗卡那霉素中选出的植株栽种于温室若干周。采用CTAB法（McGarvey和Kaper，1991），从幼叶中提取基因组DNA。两个引物用于扩增1．Zkb片段。正义引物SB1（5’GAATGG TAT ACG CTTTAC AA3’）特定于 Nt一PHY—BI。DNA，而反义引物SB2是根据pBIN19载体的序列： 5’TCC AGC CGA ATTCCC CGA TA3’。在下列条件下进行 PCR 30个周期：94℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，1分钟。在最后一个周期后，额外加 72℃，7分钟的延伸。 从菊花叶片中提取总RNA（Logemann等，1987），在 1.2％甲醛琼脂糖凝胶中分层，然后转移到尼龙膜上。探针用PRC标记（Sam－brook等，1989）。采用上述的SBI引物和一个反义引物BP2（5’ACC TGT AGT ATT CTCACT TG3’）扩增 0．3kb PHYB— 1CDNA片段。除一个（32p）一dATP整合外，采用前述的方法标记PCR。杂交接Sambrook等（1989）的方法进行。 转基因植株的鉴定：从基质的表面到顶芽为止测定单茎植株的高度。移栽插条3周后，摘去顶部Icm的梢，除去顶端优势来分析梢的分枝类型。摘心的植株在长日照下生长3周，然后移到短日照条件下。2月后，用量角器测定主茎和三个最老的分枝之间的角度。测定分析最大的水平延伸为冠径。用尺从基质表面量到株顶为冠高。用叶面积计（3100型，LI－COR有限公司，Lincoln，内布拉斯加州）测定叶面积。 比较了野生型和转基因植株叶片叶绿素的含量。两个叶盘，每个0．26cm2，从1号叶片（至少2cm长的最嫩叶片）和第五叶中取。然后置于 5mlN，N一二甲基甲酸胺中。经 2天4℃下暗处理后，移出lml提取液，在664和647urn下测定吸收值。采用Moran（1982）的方法测定总的叶绿素含量。每个基因型分析5棵植株，试验重复一次。 在远红光减弱的光下的生长反应：比较了野生型和转基因植株在相对于可见光而言远红光减少的光线下的生长情况。3周龄茎插穗的植株生长于SO0ml盆的温室中，在含选择性地吸收700—800nm辐射光染料的塑料膜下生长（Mitsui化学公司，osaka，日本）。这过滤膜提高了限定在光通量655到665nm与725到735nm之间比值的 R／FR比值。用便携式分光辐射度计（LI—1800；LI—COR）在一月份的晴天中午所测时为1．2O到1．73。对照植株生长在透明塑料薄膜下。此膜的光合作用光通量与远红光过滤膜几乎相同，但不影响 R／FR值。两者处理的温度也几乎相同。每处理含5棵植株，试验重复一次。 对施用生长调节剂的反应：通过比较矮壮素和外源赤霉酸对转基因和对照植株茎伸长的影响，来研究赤霉素在光敏色素控制茎伸长时的效应。各种基因型的茎插穗进行生根，然后生长于前述的长日照条件的温室。3周后，每盆灌 1O0ml9．5mM商品制剂的矮壮素。10天后重复灌一次矮壮素。溶于1O％丙酮溶液和0．01％（v／v）吐温 20的含 1Omg赤霉酸的10ml溶液施在梢尖，每2天一次。植株茎的高度每3天测定一次，直到15天为止。从最近干基质表面的一节算到最嫩的1cm长叶片的叶腋内的节为节数。每处理含5棵植株。 开花反应：对夜间间断（NB）（否则为长日照）条件对野生型和转基因植株的效应进行比较。每基因型8棵植株转入前述的短日照条件，并从0点到O点30分提供低照度的红光 （ 1． 2umol.m－2． s－2，植株水平）进行夜间打断。用两支20W的冷白荧光灯包一层红色的赛璐璐。 所有试验为完全随机设计。采用单向变异对数据进行分析。采用Tukey氏多重比较测试分离显著性差异的平均数。 结果和讨论 转基因菊花植株再生和分子鉴定：总计获得32株抗卡那霉素的植株。每株均取温室生长植株幼嫩叶片的基因组DNA，采用PCR分析菊花基因组中 Nt—PHY—B1 CDNA的整合情况。鉴定出了4个独立的转基因系LE31。LE32、LE46、LE56（图1，略）。在野生型植株中没有谱带的扩增，因为反义引物是根据载体的序列设计的。表现PCR正反应的抗卡那霉素的株系的百分率低，与他人在菊花转化中的结果相同。至少一部分原因是由干菊花比其它植物种类对卡那霉素有较高的耐性（Sherman等，1998） 我们的目标是高程度地表达烟草光敏色素BI基因，所以2个促进子的一个超强CaMV35S启动子（Guerineau等，1988）被选作构成型地驱动Nt—PHY—BI转基因的表达。Northern印迹反应表明，4个转基因子中的2个LE31和LE32的Nt—PHY—BI转基因的表达相当高（图IB，略）。在野生型植株中没有检测到Nt—PHY—B1信息，表明烟草和菊花B一类型光敏色素基因序列的同源性低。对这两个转基因系的生长习性进行了进一步的鉴定。 转基因植株节间较短、叶绿素含量较高：转基因系LE31和LE32植株比野生型矮，茎度下降12％到 25％（表1）。转基因植株观察到的高度的下降根源干较短的节间，而并非较少的节数；两个转基因植株平均节间长度比野生型植株少 16％到28％（表 1）。 Z:在长日照下，通过茎的插穗方式无性繁殖的植株。3周后，一半的植株转到短日照下。株高、节数、平均节间长度的测定，对长日照和短日照处理的植株依次为15天和28天后。所列的值依次代表长日照下5株，短日照下8株的平均值上标准差。 y：每一种光周期处理列内平均数的分离采用Tukey氏多重检验， P= 0．05。 LE31和LE32叶色比野生型植株略绿一些。对三者幼叶和成熟叶片的比较分析表明，LE31和LE32依次比野生型植株总叶绿素含量约高出40％和22％（表2）。转基因植株中叶片叶绿素含量增加，与在拟南芥PHYB突变子（Reed等，1993）和PHY—BI反义马铃薯植株（Jackso等，1996）中观察到的叶绿素含量下降相吻合。 Z：植株从茎的插穗无性繁殖而得，并且长在长日照温室下5周。幼叶和成熟叶依次指的是第一张叶片和第五张叶片。所列的值代表5棵植株平均数上准差。 y：列内平均数分离采用Tukey氏检验法，P＝O.O5o 因为在叶面积上3个基因型间没有差异，所以转基因植株单张叶片含有较高的绝对数量的叶绿素。最近，Thiele等（1999）已证实拟南芥PHYB在马铃薯中的异源表达，叶片叶绿素在数量上有类似的增加。在此情形下，较高的叶绿素含量导致了较强的光合作用，从而有较高的块茎产量。 转基因植株梢的结构发生了变化：光环境控制梢发育和冠结构的许多方面。这些影响的大多数是由于 R／FR的变化引起的，因此集合性地称之为避荫反应（Smith，1994 1995）。当植株处于低 R／FR比例的光环境下，许多种类避荫反应的一种现象是叶片的直立生长习性；推断为适应在拥挤下最多地接受光线（White－lam和Johnson，1982）。但是，Nt—PHY—B1基因的异位表达并不影响栽种疏或密下植株叶片的角度（数据未列出）。这一结果与在N．Plumbaginifolia的big突变体上观察到对R／FR响应中叶片角度没有变化的结果相一致。此突变子缺少一个与烟草PHY—BI非常相近的光敏色素（Hudson和Smith，1998）。 光敏色素也与侧枝的发生有关。确实是，侧枝发生的减少是许多物种避荫反应的另一个重要途径（Smith， 1994， 1995； Smith和 White－lam，1997）。但是，我们没有观察到在转基因植株和野生型植株之间侧枝数量上的差异，这表明顶端优势并未受到PHY—BI基因的异位表达的影响。尽管如此，我们观察到转基因植株侧枝生长上的一个显著的变化：较大的分枝角度（弃n。井H．LE31札LUZ四百出池住人于野生型植株，而冠高度较矮。LE31和LE32直径与冠高之比显著大于野生型植株（表3）。转基因植株冠径增大的形态学基础是侧梢和主茎之间的角度较大。 Z：在移入短日照条件前，植株摘心除去顶端优势，并在长日照生长3周。在短日照下生长2个月后，测定开花植株的直径、高度和分枝角度。所列的值代表4至5棵植株的平均数士标准差。 y：列内平均数分离采用Tukey氏检验法，P＝0．O5o 随着对光线竞争的增加，梢的结构通常发生变化（Harper，1977）。通常而言，分枝类型达到最适宜化，以减少自我遮荫和邻株引起的遮荫。降低侧校发生和或侧枝的直立生长可以将邻株引起的遮荫降到最低程度。侧枝较大的斜向生长习性，是开放群体中生长的许多植物的特性，可以最大程度地提高光的接受面积。据了解，在双子叶植物上还没有报道证实特定的光敏色素对分枝角度调节的影响。但是，在两种草：一年生黑麦草和Dallis草上，已有报道证实光敏色素在控制梢天顶角（对应于垂直线的分菌角）的影响。在这两种草中，在较高的 R／FR比例下，梢天顶角增加（Casal等， 199O； Gib－son等，1992）。当栽在没有邻株的情形下，这些草比生长在稠密群体中的植株的梢具有较大的斜向生长习性。其结果是每棵植株可以截获较高比例的入射光（Casal等，1986）。因此，烟草光敏色素BI的一个可能的功能是随光线环境的变化控制分枝角度。 在远红光减弱的光线下转基因菊花表型模拟野生型植株的株冠：为了研究转基因菊花茎生长抑制的机制，将植株栽种在采用一个光谱选择塑料过滤器，使中午时刻光线的 R／FR比例从1．20提高到1．73的光处理下。与前述的试验一样，在对照条件（透明塑料膜）下， LE31和LE32均矮于野生型植株。但是也表型模拟生长在FR减少的光线下的野生型植株（图2，略）。但当置于FR减少的光线下，转基因植株的生长并没有进一步下降，表明烟草光敏色素B1并不是避荫响应的传感器。 许多植物种类避荫响应的另一个特征是随着R／FR的下降，包括叶面积生长、叶绿体发育和叶绿体合成等的叶片发育延缓（Smith，1994，1995）。相反，将菊花等许多植物种类转入FR减少的光环境时，每单位面积有较高的叶绿素含量（ McMaho和 Keily，1995； Ra－japakse等，1999）。我们也观察到生长在光谱过滤器下的野生型菊花植株的叶片比对照条件下生长植株的叶片约多 20％的叶绿素含量（图2B，略）。但是，在R／FR增加条件下，野生型叶片较高的叶绿素含量并没有与生长在透明塑料下转基因植株的含量有统计学上的差异。并且，将LE31和 LE32置于 FR减弱的光环境下，并没有造成叶绿素含量的进一步增加（图2B，略）。 本文的结果表明，烟草光敏色素BI是红光的传感器，其在转基因菊花植株中的异位表达，仅增加对红光的敏感性，而造成抑制茎的伸长。类似地，与来自于拟南芥PHYB亚组光敏色素不同的是，由HLG编码的N.plumbagini-folia中非常近缘的光敏色素，不是低R／FR的传感器，相当专有地响应红光（Hudson等，1997；Smith和 Whitelam， 1997）。在一个近缘的种类，即番茄的光敏色素BI同系物上也得出了相似的结论（va n Tuinen等，1995）。 PHY—B1基因的表达是通过一个并不直接与赤霉素合成有关的机制来减少生长：我们已指出了LE31和LE32两者的生长状态类似于生长在远红光减弱的光下的野生型植株。赤霉素已被认为是在不同的R／FR下，部分参与调节菊花植株的高度（Rajapakse和Kelley，1991； Rajapakse等， 1999）。支持这一假设是根据过度表达燕麦（Avena sativumL．） PHYA基因的转基因烟草内源赤霉素含量的下降（Jor－dan等，1995）。在缺乏光敏色素B的高粱（Sorghum bicolor L．）的 ma3R突变体中观察到较高的内源赤霉素含量（Beall等，1991； Childs等，1997）。因此，我们研究异位表达烟草光敏色素BI的菊花是否包括赤霉素的生物合成。 用一种赤霉素生物合成的抑制剂矮壮素处理后，内源赤霉素的含量下降（Sponsel．1995）。这种处理均造成野生型和转基因植株节间长度变短（表4）。但是，用矮壮素处理的 LE— 31和LE，32的节间平均长度仍然比矮壮素处理的野生型植株要矮（表4）。并且，不论对照或矮壮素处理的转基因植株与野生型植株之间平均节间长度的绝对差异是几乎相同（ LE－31为1．3和1．5；LE—32为0．9和1．1）（表4）。仅用赤霉酸处理的野生型和转基因植株，赤霉酸均能完全恢复两者的生长。尽管如此，外源赤霉酸不能逆转由烟草PHY—BI基因表达所引起的茎长度的下降（表4）。相类似地，外源赤霉酸不能完全恢复拟甫芥PHYB过度表达个体下胚轴的生长（Wagner等，1991）。 Z：植株为茎的插穗无性繁殖而来，并生长在长日照条件下。3周后植株灌9．5mM矮壮素溶液，茎尖施于10mg赤霉酸。每两天一次，总计7次处理。或者矮壮素与赤霉酸结合使用。所列值代表5棵植株的平均数士标准差。在处理开始的第15天测定节间长度。 y：列内平均数分离采用Tukey氏检验法，P＝0．05. 不论采用何种处理方法，两个转基因系的平均节间长度总是比相同处理下野生型植株短1．2mm左右（表4）。换名话说，转基因表达和生长延缓剂处理对茎生长的共同效应是单独应用时效应的总和。对这种结果的一种解释是：赤霉素并不调节转基因植物中红光诱导的茎伸长的抑制。一个类似的基本原理用于争辩赤霉酸在对光敏色素控制的芥子（SinaPis alba L．）下胚轴生长时可能的作用（MOhr和 Appllhn，1962）。 有一些试验的独立结果为上述结论提供了相似的证据。首先，在缺乏B型光敏色素的黄瓜lh突变子或豌豆Iv突变子上（LoPez－Juez等，1995；Weller等，1994），或拟南芥 PHYB突变子（Reed等，1996）上，内源赤霉素的含量并没有改变。其次，在若干事例上已证明赤霉素和光敏色素调节与生长有关的独特的细胞过程。在 Thlaspi arvense L．中，多数由赤霉素诱导的叶柄生长和茎生长取决于细胞数量的增加，而在这些组织中光敏色素对生长的调节局限在控制最终的细胞长度（ Metzger，1988； Met－zger和 Dusbakek 1991）。 Nt－PHY－BI的表达对夜间打断敏感性仅有微效应：菊花是种短日照植物（SDP），当暗周期长度大于9．5 小时就开花（ Larso；1992）。为了商品性生产菊花，在开花诱导前，需要一定数量的无性生长。在诱导长夜的中途用低照度的光进行夜间打断（NB），可以维持无性生长。夜间打断抑制短日照植物开花的最有效的波长是红光，并且光敏色素B主要负责调节NB—R响应（Thoma和Vince，1997）。确实是，在短日照烟草栽培品种中，PHYB的异位表达显著地增加了对采用荧光灯提供的3O分钟夜间打断的敏感性（Halliday等，1997）。另一方面，在马铃薯中，通过反义RNA抑制PHYB的表达，打破了由夜间打断引起的块茎形成的抑制作用（Jackson等，1996）。根据这些变化的光敏色素B水平对夜间打断响应的效应，我们也测定了是否烟草PHY—B的表达也增加菊花对夜间打断的敏感性，这将对减少为维持植株无性生长状态所需要的最低的夜间打断的时间有实用效应。因为我们先前已证实烟草光敏色素BI调控红光诱导的对茎伸长的抑制，因此我们测试光敏色素BI的异位表达是否也参与调节短 日照菊花开花的NB—R抑制。采用足够于延期、但并不完全阻碍开花的NB－R（3O分钟）来进行测定。 如表5所示，光敏色素BI的异位表达并没有影响短日照条件下花的形成和发育。但是由亚适宜的NB—R引起的开花的延迟，在转基因植株中长干野生型植株。肉眼可见的花芽和花芽开放的额外迟延依次为4到5天和17到20天（表5）。观察到的肉眼可见花芽出现的时间在转基因植株上略推迟，表明其花原基的起源与野生型几乎处于相同的时间。这与花芽开放之非常大的效应相结合，表明光敏色素BI异位表达的主要效应是对花发育的调控而不是花的诱导。这是未预料到的，因为花和花序的发育是生长过程，同时我们在前面也已指出转基因植株茎生长的下降。尽管如此，在不同的NB条件（例如高的光通量或长的持续时间），对诱导过程的一种效应将更明显，这仍然是可能的。 Z：植株由茎的插穗无性繁殖而来，并生长于长日照条件下。3周后植株置于短日照或短日照从0点到0点30分钟的红光夜间打断。记载了从处理开花到花芽出现和开花的天数。所列值代表每处理8棵植株的平均值±标准差。 Y：列内平均数分离采用TUhy氏检验法，P＝0．05o
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