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以BAR基因为选择标记转化三个兰属植物
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关键词：微粒子轰炸 Bialaphos BAR基因并非 兰花转化 缩写： DtpS：五唇蝶兰，GUS:β一葡糖醛酸酶,Luc ：荧光素酶，PAT：膦丝菌素乙酸转移酶，PCR：聚合酶链反应，PVC：收集细胞体积，PLB：原球茎状体，PPT：膦丝菌素 引言 数十年的传统育种己应用于生产和改良多种类型的商品性兰花。但是，仍留下大量的性状，包括对病虫害的抗性、对胁迫的耐性、花色。香气、大小和株型的改良以及生长习性等可能适合于通过以基因转移技术为基础的现代育种方法的进一步的兰花遗传改良。一些研究已探索了将选择标记或报道基因整合到兰花中的可行性，包括 GUS（Griesbah和 Hammond 1993），萤火虫荧光素酶（Chia等，1995）和NPTll（卡那霉素的抗性； Kuehnle和 Sugli， 1992）。在这些试验中，未成熟胚、原球茎和原球茎状体（PLBs）作为靶组织使用（ Chia等， 1995； Gries．bach和 Hammond,1993；Kuehnle和Sugli，1992）。 兰花天然地抵抗用于遗传转化植物细胞选择的许多常用的化学物质，如卡那霉素和潮霉素，进一步造成开发转化组织恢复的选择策略的困难（ Chia等， 1995； Hauptmann等， 988）。已证实 100－200 mg/1卡那霉素可对转化的石料兰组织进行有效的严紧性选择，但是非转化的细胞的死亡随品种而异，需长达3．5个月或更长的选择周期（Nan和Kuehnle，1995）。 通过成功地采用荧光素酶Luc基因作为兰花转化组织的非侵染性标记，已无需依赖于使用卡那霉素等氨基糖昔（类）抗生素进行选择（Chia等，1995）。通过使用光子计算视频影像照相机——光电倍增管系统监视生物发光来证实组织的转基因本质。手工切下生长的组织，连续进行继代培养，然后使其发育成小植株。虽然这系统获得了转基因的石搬兰植株，但此法费力费时，费用昂贵。鉴于简单、有效和重复，最适合的系统应当是一个非转化的细胞被选择性地杀死，而同时转化的组织和细胞并不受选择剂影响的系统。 本文报道了使用对广谱除草剂膦丝菌素（PPT；Thompson等，1987）具有抗性的选择性标记基因BAR的一个简单、快速和有效的兰花转化系统。通过带放线菌BAR基因（GordonKamm等，1990）的粒子轰炸，转化了兰花的原爱莫能助球茎或切碎的原球茎状体。转化的细胞用一种PPT（Gorden—Kamm等，1990）的丙氨酸衍生bialaphos进行选择并通过分子水平和功能分析证实了具有抗性的、转基因的再生植株。三个差异很大的、无亲缘的兰属：EPidendroidae亚科的卡特兰属、Cymbideae族Vandoideae亚科的长萼兰属和Vandeae族Vandoideae亚科的五唇蝶兰属（Doritisk77halae。psis）（Dressle－Fg 1981）成功的转化，表明了这种方法可能适合可以通过组织培养的任何一个兰属的转化。 材料和方法 植物材料 杂交组合 Brassia rex‘Sakata’FCC／AOSX Brassla verucosa的兰花原球茎从 De Rosa兰园（Natick，马萨诸塞州）获得。原球茎在125ml带棉花塞的三角烧瓶的5oml液体培养基中增殖［Phylamax兰花增殖培养基（Sgma ,St．LoutS，密苏里州），高压灭菌前调pHS．8］。培养物培养在室温（约25℃），130rPm摇床，12小时光周期，光照强度为 40molm-2s-1 由冷白荧光灯管提供。 卡特兰（Catteya Gorgianax Self）的一个绿色蒴果也从DeRosa兰园（Natick，马萨诸塞州）获得，在 100％乙醇火焰上灼烧进行表面消毒无菌地移出未成熟胚，胚在固体种子播种培养基上萌发［Phytamx兰花维持培养基（Sigma）含34g／l香蕉婴儿食物（Gerber）和Zg／l活性炭，用 0．8％（W／V）TC琼脂（Sigma）固化，高压灭菌前调 pH5． 8］。培养皿用Parafilm密封。培养物在上述的室温（约25℃）12小时光周期下培养。 五唇蝶兰 Su’s Red Lip‘Ching Hua 11℃’FCC/AOSX五唇蝶兰Amour Rojo BonnieVasquez’用从J＆L兰园（Davis，康涅狄格州）获得的蝴蝶兰（Phalaenopsis）的花粉进行授粉受精。此杂交组合结成的蒴果在发育3个月后采收，未成熟胚按上述的卡特兰的方法培养。 为增殖大量的PLBS用于轰炸，原球茎用无菌的解剖刀片切碎，切成约2mm3的小片。约0．5—1.0克的组织转入到含50ml液体增殖培养基的带棉花塞的125ml三角瓶中。培养物培养在室温（约 25℃），130rpm,12小时光周期（光源同前述）。增殖组织的切片和转移到新鲜培养基上的操作每2—3个月重复一次。 2月龄的PLBs，从液体或固体培养物转入含固体再生培养基［Phytamax兰花维持培养基十Zg／l活性炭,O.8％（W／V）TC琼脂固化，高压灭菌前调 pHS.8 培养皿（100mmpΧ15mm），封于Parafilm，以诱导形成小植株，培养物置于室温（约25℃），12小时光周期。 用干选择的bialaphos的浓度（起始选择为lmg/1,接着3mg／1致死选择）是根据长萼兰PLBS和卡特兰原球茎的杀灭曲线而定（数据未列出）。这些数据表明，在培养皿的固体增殖培养基上3周后，两种兰花的细胞在lmg／lbialaphos时生长完全受到抑制，在3mg／lbialaphos下连续培养8周造成组织变黑、死亡（数据未列出）。较高的浓度，直止10mg／lbialaphos对 PLB生长的抑制和致死的速度并未加快。非转化的五唇蝶兰PLBS表现出对bialaphos类似的敏感性（数据未列出）。 兰花转化 按原球茎增殖方法（前一节制备的切碎的PLBs Chia等， 1995，）作为长萼兰和五唇蝶兰微粒子轰炸的靶材料。新萌发种子形成的原球茎用作卡特兰转化试验的靶材料，切碎的PLBS（Zml收集细胞体积）或完整的原球茎（Zml收集细胞体积）转移到无菌的 Whatmanl号滤纸环状物上，真空抽吸除去剩余的培养基。滤纸转入到固化的增殖培养基上，在数小时之内用Bio—Rad PDS— 10O0／He Biolistic粒子发射系统（Bio—Rad，Hercules，加利福尼亚州）进行轰炸。含559 hp BAR基因的编码区，受根瘤农杆菌CaMV35S启动子和转录物7（Tr7）终止子转录性控制（图1，略；Spencer等，1990）。质粒DNA（pDPG 165）采用 CSCI梯度离心进行分离（Sambrook等，1989），按制造商（Bio一Rad）的指令将其沉淀在lum金粒子上。10ul的DNA悬浮液分散于每个微载体盘上，并使之干燥。轰炸参数为： 1100 psi破裂盘。从破裂盘到微载体沟距为6mm，6mm微载体飞行距离，6cm终止屏到目标物距离，28英寸汞柱部分真空。每属兰花轰炸10个培养皿的材料。 转化子选择： 粒子轰炸后，允许组织在室温、光周期为12小时的固体增殖培养基上恢复48小时。恢复期后，组织转移到lmg ／1 bialaphos培养皿的 固体增殖培养基上,在此培养基4周后，组织转到 125ml三角瓶含 3mg／lbialaphos的 50ml的液体增殖培养基上，室温下培养，130 rpm，12小时光周期。8周后，收集增殖的PLBS，切成2mm’的小块，转到含3mg／lbialaphos的固体增殖培养基的培养皿中。在此阶段直径小于lmm的卡特兰的原球茎不切碎。在 3mg／l bialaPhos中增殖的绿色组织切下后，转人含 3mg／lbialaPhos的固体增殖培养基中进行第 z 个周期的选择。切下和选择进行第三次重复.五唇蝶兰绿色的PLBS和PLB丛转到不含 bialaPhos固化再生培养基的培养皿中再生成小植株。长萼兰和卡特兰PLBs转到含3mg／l bialaphos的固体增殖培养基上。3—6月后可见到植株，然后维持在200 ml玻璃瓶不含选择剂的4Oml再生培养基中。瓶子用B—Caps（Magenta公司，芝加哥,伊利诺斯州），并封于Parafilmo 核酸分离和分子分析： 从12－15月龄再生培养物的整棵植株和PLBs，提取DNA和RNA（Knapp和Chandlee，1996），用于Southern和Northern印迹分析。在上述选择条件下再生的长萼兰和五唇蝶兰小植株的基因组DNA（8ug）用BamHI消化，然后用1％琼脂糖凝胶电泳（Sambrook等，1989）。 此 DNA用 10 X SSC按生产商推荐的程序印迹到 Green Screen Plus正电荷的尼龙膜上（DuPont／NEN，波士顿，马萨诸塞州）。通过紫外线交联（Stratalinker，Stragene，Lajolla,加利福尼亚州）将DNA固定到膜上。质粒PDPG165（图 1，略）的 1． Ikb的 BamHI／EcoRI片段，用32p 一dCTP进行放射标记。参照 Probe－Eze。 Labeling Kit（5’－ 3’， Boulder，科罗拉多州）或 01 igoLabeling Kit（Pharmacia LKB， Up－salla，瑞典），按生产商的说明进行。印迹用相 同的探针进行杂交，采用多重三明治法（Wll 等， 1995），杂交缓冲液包含 50％甲酸胺，在 42℃下进行 16— 48小时。在室温下用 2 X SCC 对印迹清洗2次，每次5分钟，在室温下用ZX SCC＋l％SDS清洗15分钟，然后用2 x SCC 淋洗除去SDS。印迹膜置于折叠机（BRL， Gaithersburg，马里兰州）中，然后曝光在柯达X 一omat AR胶片上。－70℃ 16—48 小时。 由于只有很少量可用的组织，卡特兰假定 转化子DNA量非常少。因此采用狭线印迹（Slot blot）来判断这些样品中转基因的存在。lug基因组 DNA在室温下，用 0．25 N Na0H、 0．5 N NaCI变性处理 10分钟，然后样品用 0。2 X SCC1：1见稀释。采用 Hybrislot Manifold （BRL，Gainthersburg，马里兰州）将这些DNA 转到 Greenscreen Plus膜上。转移完成后，膜在 0．5N NaCI、 O．5M Tris—HCI，pH7．5中和。通过紫外线交联将DNA固定在膜上（Stratali －uker，Strategene，La Jolla，加利福尼亚州）。按S0uthern印迹的方法，将狭线印迹膜进行预杂交。杂交、清洗和曝光在胶片上。 总叶片RNA( 5ug) 在变性的1．5％甲醛琼脂糖凝胶中电泳（Sambrook等，1989）。根据制造商推荐的程序，将RNA印迹到GreenscreenPlus正电荷尼龙膜（DuPont／NEN）上。通过紫外线交联（Stratalinker）将RNA固定在膜上。然后，在80℃下烘2小时以除去任何残留的甲醛。按Southern印迹的方法，将pDPG 165的1． Ikb的 EcoRI／BamHI片段用32P— dCTP进行放射性标记。采用多重三明治法（Wu，等，1995），在含 50％甲醛的杂交缓冲液中。用相同的探针多重印迹膜杂交后，印迹膜在室温下用ZXSSPE清洗2次，每次5分钟。一次在室温下用 ZXSSPE＋2％SDS清洗15分钟，然后用ZXSSPE淋济除去SDS。印迹膜置于显影折叠机（BRL）内，用柯达 X—omat AR胶片在一70℃下曝光16—48小时。 除草剂使用分析假定转化组织再生的植株进一步采用除草剂来分析转基因的表达（G0rdonkamm等， 411990； Hartman等， 1994）。用一枝画笔将溶于0．1％ Triton X－100的 bialaphos（Zm g／ml）直接涂在小植株的叶片上，然后再将小植株置回到200ml含固体再生培养基的玻璃瓶内。封于B—Cap和Parafilm。培养在室温（25℃）和12小时光周期下，4周后判断除草剂的效应。 结果和讨论 转基因植株的转化、选择和再生 通过开发出不依赖于根瘤农业杆菌的DNA发射系统，以及筛选出合适的选择药剂和选择标记，大大便利了单子叶植物的遗传转化。一个这种选择标记就是从放线菌（S．hygro－scopies）中分离的BAR基因，其具有抵抗广谱除草剂PPT和PPT的丙氨酸衍生物bialaphos的能力，已经表明PPT和bialaphos既是双子叶植物又是单子叶植物转化的有效选择剂（De－Block等， 1987； Dekeyser等， 1989； Gorden－Kamm等， 1990； Hartman等， 1994； Spencer等，1990； Wan和 Lemaux， 1994），并且用于一系列单子叶植物转化细胞和组织的选择，包括玉米。大麦和草坪草（Gordon－Kamm等，1990；Wan和 Lemaux， 1994；Hartman等， 1994）。 本文建立了一个用BAR基因转化的兰花组织恢复的选择策略。卡特兰新萌发的种子或长萼兰和五唇蝶兰切碎和PLB组织，各IO皿，用一个含 BAR基因的质粒（ pSPG 165； Gorden一kamm等，1990）进行轰炸。最初4周在固体培养基上选择时，90％的组织坏死，仅有少量有小丛保持绿色（图2，略）。在经过16周选择，并将增殖的PLBS转入到再生培养基后，计算转化效率。在总计30 M轰炸的组织中，获得了32株假定转化子：11株长辈兰、18株五唇蝶兰和3株卡特兰。与采用卡那霉素作为选择剂选择转化组织的方法相比，本文报道的方法有一系列的优越性。因为bialaphos（约lm g／l）在使用4周内可有效地抑制兰花PLBS的生长。在3mg／lbialaphos 4周内观察到组织死亡，所有的对照组织在8周内坏死。 假定转化兰花的分子分析 具足够数量组织的假定转化植株，首先进行PCR分析以确定BAR基因的存在与否。通过此分析得出2株长萼兰、2株卡特兰和6株五唇兰PCR呈正反应（数据未列出）。具有足够组织量的一些假定转化的长等兰株系进行了Southern分析，鉴定出两株的转基因整合到植物基因组DNA中（图 3A，略）多在长萼兰11系和12系中出现的多条谱带表明有多个插入位点、pDPG 165质粒的重排或重组或者为DNA样品的不完全消化。在未消化的DNA中，探针与大于23kb的DNA杂交，这表明转基因是整合基因组DNA中，而不是作为独立的质粒维持。类似的结果也在假定转化的五唇蝶兰中观察到（图3，略），3个独立的转化系具有不同的杂交谱带类型。杂交信号的强度和复杂限制性类型表明样本 Dll可能也有多个整合位点。有可能至少一条带代表非特异性杂交，因为在对照格中有一条非常弱的带存在（图3B，略）。卡特兰样本 CI与质粒 PDPG 165的1．Ikb片段的杂交非常强，因为在一个狭线印迹中显出（图3C，略）。 从假定转化系中提取的总RNA的Northern分析表明，存在着一个大约800hP长度的转录物（图4，略）。这是一个预期大小的包含500 hp BAR基因编码区和 Tr7 Poly A尾巴（图1，略）的嵌合的RNA。在一些样品中观察到第二条 500hp的谱带，可能代表缺少P0lyA尾巴的转录物。 除草剂使用分析 转化子对直接施用在叶片上的除草剂（bialaphos）的反应提供了转基因功能活性的令人信服的证据。在长萼兰、卡特兰和五唇蝶兰对照植株上直接使用 Zmg ／l的 bialaphos，在正常生长条件下4周以后组织坏死（图5，略）。最终坏死从处理的叶片扩展到假鳞茎（长萼兰和卡特兰）或根茎（五唇蝶兰），并在多数情形下对照植株最后死亡（图5，略）。相反，6个转化子系（PCR、Southern和Northern正反应）（图5，略）处理后的叶片，即使到了4个月后仍保待绿色和健康。对照植株的叶片在除草剂处理后的几周内变成透明状，然后转成黑色或棕色，最后全株死亡。而转基因植株的叶片保持绿色，植株生长旺盛。在少数情况下，假定转化系施于除草剂的叶片区域组织出现坏死，但是症状并不扩散，最终完全恢复。 在这些试验中，从全部3个属再生的转基因植株表现正常，与对照植株之间在形态上没有可区别性的差异。但是，有关过度组织培养引起兰花体细胞无性系变异的报道有许多。重复的切片和选择对转基因植株未来的可育性和花形态发育的影响要到2—10年后植株成熟时才能测定。这些兰花缓慢的实质生长习性也限制了通过回交、FI和FZ后代分析证实转基因 稳定整合。但是，这些试验仍在进行之中。将BAR基因引入到三个属中任—一个属一些兰花中，在含bialaphos的培养基中进行选择和恢复转化的植株。我们相信这一选择和鉴定转化PLBS的系统有可能设计出将重要经济性状引入到任一种可离体培养的兰花属中的策略。
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