摘要：〖HT〗应用生物反应器技术进行植物组培苗的大规模繁殖生产是一个非常有前途的工业化繁殖系统，通过对植物的嫩枝、鳞茎、小块茎、球茎等不同植物组培苗的大规模繁殖的回顾和总结，本文阐述了生物反应器的结构特点及其操作技术。
一、简介
植物组培技术在全世界被广泛地用于商业化生产具重要经济意义的植物，包括观赏植物、蔬菜、果树、木本植物和药用植物，尽管我们对组培植物苗的需求不断地在增加，然而应用现行的常规组培方法来大规模生产植物组培苗时，还存在一些问题，一是大量生产植物幼苗时效率较低；二是成高本；三是组培苗从组培状态过渡到土壤中时遇到的问题。目前，商业生产组培苗时，一般在半固体培养基上进行手工操作，这些因素是导致繁殖效率低下和成本较高的原因。
在这种情况下，我们就需要一种用简单的生产设备和技术就能大规模繁殖生产植物组培苗的新工艺，从而降低劳动强度和成本。包括自动化生产、光合自养生物培养和生物反应器技术等许多新工艺已被试用过，其中生物反应器技术是最有希望成为实用而有效的体外商业化大量繁殖生产组培苗的技术。生物反应器是常被用来实现一组生物反应的容器，它也可以是被用于培养需氧细胞或用于固定于基床上的多层细胞和酶的反应器。作者已经应用需氧生物反应器培养技术来大规模生产百合、草莓、马铃薯等植物的组培苗，生物反应器技术及其技术特点也可见于其它报道。并被用于多种植物种类的芽和体细胞胚胎繁殖。
根据我们的实验结果，一些关于生物反应器操作、生物反应器系统的基本特点和在生物反应器内繁殖不同植物组培苗等问题，都在本文之中作了描述。
二、用于植物组培苗生产的生物反应器类型
已开发研制出多种类型的生物反应器，其中作者正在使用的通气和气泡柱生物反应器设计最简单。这些生物反应器的基本结构由反应容器配以进气口、出气口、接种口、进料管、采样管和沉没电极柄组成。实验室级别的实验必须有测量和控制系统，但实际上，一般不用在商业繁殖上，最简单的生物反应器由培养容器、接种口、进、出气口组成。
一些植物的嫩枝、鳞茎、小块茎、球茎、胚根等已在这些简单的生物反应器中成功地繁殖出大量的组培苗。组培条件，特别是培养基的化学组成和再生技术对于不同植物种类、不同的植物材料部位和不同的培养方式有着很大的差别，这些因素都影响着生物反应器类型的选择。
三、有关生物反应器的操作问题
在生物反应器中繁殖植物时所遇到的问题有：微生物污染、培养基变性(褐化)、种子培养物接种、通气方法、光照、生物反应器中生物量的估计。对这些问题的解决方法如下：微生物污染：许多因素都可导致微生物污染，其中硬件的设计、构造和操作错误是最主要的原因。为了使污染达到最小，生物反应器的结构应最简单，同时连接反应舱的管道联接器和培养容器的开孔(如接种口等)的数量应尽可能地少。空的生物反应器舱应事先在121℃高压下灭菌30分钟，生物反应器装备完备后，再在121℃下灭菌15分钟，通气常会造成微生物污染，应在通气口装有可置换的和可高压灭菌的超级过滤器(孔径大小为0.2～0.45μm)，用于过滤进入反应器中的空气。空气出口处有时使用玻璃纤维过滤器，它一旦让培养基液溅湿，便可使微生物侵入，一个简单的方法是使用具端部开口的螺纹管(约1米)来预防微生物侵染。另一个广泛存在的微生物污染问题是螨虫的大量繁殖，用于培养的接种体，有时会被螨虫侵污(图1)。（略）图1：在含有10毫升MS琼脂培养基(30克蔗糖、8克琼脂)的300me锥形烧杯中的螨虫分布(盖铝箔)。X轴表示锥形瓶的型号，箭头表示锥形瓶中有200只螨虫，Y轴表示螨虫污染百分数，数据为三个重复的平均值。因而在接种到生物反应器中后产生了污染，为避免这些问题，应定期地熏蒸消毒培养室，且作为一个最基本的常识，应把母株接种体保存在具有海绵硅塞的试管中。培养基的变性：高压灭菌后，培养基浓度，特别是蔗糖浓度增加时，可观察到培养基褐化。变性的培养基常抑制培养物的生长，为避免这一现象，蔗糖溶液应该与盐溶液分开灭菌。在开始培养时，才将灭菌的蔗糖溶液和盐溶液掺和在一起。作为种菌的培养物的接种，一般来说，在生产箱或小规模生物反应器中培养接种物时，通常
使用微生物或植物细胞悬浮培养法作为种子来培养。接种可通过用连接于生物反应器上的接种管将生长在先前生物反应器内的培养物注入生物反应器中实现。当植物在生物反应器中大量繁殖后，这种简单的接种方法在实际中很难实现，这是由于被接种的组织片断常常堵塞了接种管道，常用于繁殖生产组培苗的接种组织片段一般为嫩枝、不定芽、腋芽、球茎、鳞苞或小球茎碎片。这些组织片断常通过接种口接入。手提式的生物反应器(1-20升)可放于干净的作台上，且通过镊子将待培养物从接种口将接种物接入生物反应器中，最好用甲醇或环形燃烧器的火焰烧灼接种口灭菌。有关准备接种物的技术内容将会在后面描述。氧需求和氧供应：由于在生物反应器内培养的植物组织片断必须为需氧培养，因此，通气是一个最基本的先决条件。压缩空气从生物反应器底部的喷嘴中喷出。通气效率可通过氧气的导入系数来评价，氧气导入系数主要由通气率和气泡尺寸决定。因此，空气喷嘴的类型决定着氧气导入系数的高低。一个氧气导入系数对生长影响的例子为：在生物反应器中繁殖的草莓，其芽的生长与氧气导入系数和通气率呈正相关。为了达到足够的生长率，氧气导入系数必须超过10。通常使用的直径约0.5-1mm的不锈钢或黄铜管喷嘴(棒或环状)，所产生的气泡太大而达不到所要求的氧气导入系数，因此，为了达到足够的氧导入系数，必须提高通气率，但提高通气率会造成培养基被搅动而造成较大的机械剪切力，从而使生物反应器中的培养物受到损害，且使其生长受到抑制。为了在不产生剧烈的机械剪力前提下提高通气率，应使用陶瓷或烧结的钢质多孔喷嘴，它们可产生直径很小的气泡。最近，一种由合成橡胶制成的多孔喷嘴的氧气通气管，已证明可产生良好的通气结果。它产生极小直径的气泡，达到高的氧气导入系数，低的机械剪切力且成本很低。
照明：在生物反应器中，为植物组培苗照明是相当困难的，因为光在通过植物组织后光强度呈对数级消减。例如：生长在玻璃制的生物反应器中的芽幼苗培养物在外部用日光灯照射时，光仅仅照透幼苗培养物表面以下几厘米，所以，大多数培养物因为未受光照而变白。为使光更好地导入生物反应器中，我们已尝试过许多不同的方法，例如把照明系统放入生物反应容器中，一个大型的生物反应器(500升)配有4盏灯，它是特别为繁殖stevia芽的培养而设计的。当在培养基表面上的光照强度恒定在20000lux时，在培养基表面上的芽培养物长出绿叶，但培养基内部的芽因缺光而变白。将光导入生物反应器是一个问题，且是非常困难的。因此，在开发新的植物繁殖培养技术时，应考虑用较低的光照或不用光照的植物繁殖技术。生物反应器内生物量的估计：在繁殖生产植物组培苗时，培养物的尺寸有时会超出样品管的内径，这样就不可能直接测量样品细胞团的大小。在生物反应器内经常使用最简易的测量方法之一是测量培养基EC值的减少量。EC值相对于其初始值的减少量与在生物反应器内生长繁殖的组培苗的干重呈高度的相关性。培养物的EC值可通过EC电极探测器持续不断地检查，当然，也可以通过分析培养基来离线测量培养物的生长量。笔者同时也试看建立起一套成熟的技术来在线测定细胞的生长量，它采用由发光二极管和感光二极管(光探索传感器)组成的光学方法来测定。光在培养基中的指数消减常数，由电荷释放和超声波方法测定。将这些实验技术应用到实践中的方法现正在开发之中。为分析培养物培养过程中的生理生化指标，实践中需测定下列项目：
在植物细胞、组织、器官培养中需测定项目及其所需仪器：
测量参数：传感器或仪器
定量测量：
细胞生长：光吸收传感器、放电器、超声波、稀释器、电传导器、糖消耗感应器
细胞数量：细胞计数器、图象分析器
PH：PH传感器
溶解氧:溶氧测量器
气流速度:细胞团流动测量器
搅动速度:旋转测量器、频闪观测仪
电泡：接触电极
基质浓度：HPLC(高压液相色谱)酶电极、GLC(气相色谱)
离子浓度：离子电极、原子吸附仪、火焰光度计、离子色谱
培养基表面层：负载细胞
O2(进、出气口)：O2电极
CO2(进、出气口)：红外线气体分析仪
定性分析：
温度：热敏电阻、铂电阻器
光照：感光盒、感光二极管
渗透压：蒸汽压、凝固点
旋转力度：旋转力矩器
四、大规模生产不同植物组培苗的技术
生物反应器适于由一小块接种物(种子培养物)批量的大规模生产各种植物的组培苗。一些生产者在这方面的经验如下：
草莓：由于病毒侵害，草莓的产量可显著地减产，所以通过组培繁殖的无病草莓植株被草莓种植者广泛使用。利用生物反应器繁殖草莓要比一般的组培容易，但大规模繁殖草莓组培苗以满足商业需要相当困难，生物反应器技术对于大规模草莓繁殖来说是一种非常有前途的方法。带有许多腋芽的组织茎段(70-150芽／每片)，可在含高浓度细胞激动素的琼脂培养基上培养出来。这些茎段转移到10到20升的玻璃制生物反应器中后通气。通气率要高到足以使培养物上升到液体培养基表面，这样才能使腋芽发育成小植株，细胞激动素的浓度是决定植株的生长速度和植株移植到大田中成活率的关键因素之一。
百合：本文作者首先发明且报道了通过生物反应器来培养百合的基本过程和方法，并获专利。百合在体外由鳞茎球，再生出的许多子球，被用于在生物反应器中生产小鳞茎球，培养基的成份，特别是铵离子，强烈地影响着小鳞茎球的再生。在铁炮百合和其他百合繁殖中，MS盐份成份可抑制小鳞茎球的形成并刺激愈伤组织的形成。当采用高盐浓度的MS培养基或铵离子浓度减低时，小鳞茎球可正常再生并且愈伤组织的形成被抑制。在大规模组培百合过程中，大量的准备接种所需的接种鳞茎球是一个问题。最容易和最有效的方法是在生产过程中将体外繁殖的鳞茎球随意切割后接种入生物反应器中。作者已报道了一个大规模地繁殖百合组培苗的改进方法，即由悬浮培养细胞再生为百合植株，或直接将组培繁殖出的鳞片栽种到无菌沙土上再生出鳞茎球。
风信子：其自然分蘖小鳞茎繁殖率很低，风信子栽培者主要使用两种繁殖技术：从鳞茎中挖取小块繁殖或将鳞茎划成几部分繁殖。采用这两种常用方法的繁殖率并不高，且常会造成病毒侵染。组培技术可解决这些问题，但繁殖率也并不高，采用摇动培养可刺激风信子组培苗的生长，在三个月内，可使培养室中的40%左右的小球茎超过1克重，这相当于挖取小块繁殖法所取的鳞茎球的尺寸。
朱顶红：采用常规的双鳞苞方法繁殖朱顶红是非常困难的，因为其繁殖率很低并易导致病毒侵染等。尽管已有采用割下的鳞苞可在体外繁殖出新植株的报道，但这些方法不适合于大量繁殖商业用朱顶红幼苗。为在体外繁殖刺激朱顶红的生长和再生，需采用ABA(0-0.1毫克／升)的液体MS培养基并辅以光照。在此情况下，鳞苞碎片培养在10升的玻璃发酵坛中，坛中装有5升不含ABA的MS液体培养基并辅以光照，这样鳞苞切片可在发酵坛中充分地繁殖。
唐菖蒲：栽种者可用其球茎上的新的小球茎来繁殖唐菖蒲，但需仔细地选好种球，以防疾病传播。唐菖蒲在琼脂培养基上的组培方法已由Bajai
et al建立了起来(1982年)。但其繁殖效率不高。应用生物反应器繁殖的方法报道，它采用青霉素光合成抑制剂来诱导产生原球茎，这些原球茎随后在固体培养基上培养，产生出小植株或不休眠球茎，它们可以直接种植在大田里或储藏起来，作者同时也建立了不同的繁殖体系。用10克／升蔗糖的MS培养基，芽就在生物反应器中充分生长。当芽在生物反应器中充分生长后，再加入蔗糖溶液直至浓度为90g/升。用此方法在生物反应器中，小球茎会在芽的基部位置产生。
芋、半夏、魔芋、烛台花：这些植物属于天南星科植物，且在种间的体外培养特征方面非常类似。例如，一个共同的特征是所有的种类都可形成可再生的原球茎，这种原球茎能通过连续再培养而繁殖，且在转移到适合的液体培养基中后，他们能发出新的小苗。一个典型的例子是芋的小球茎的繁殖。这个程序的第一步是在生物反应器中建立起芽的繁殖方法，条件是用30克／升蔗糖浓度的丰盐MS培养基，一个20升的玻璃生物反应器内装有15升液体培养基，用生长在5个锥形烧杯中的幼苗培养物(全部培养基容积约300亳升)，接种培养55天后，可顺利地收获生长良好4650株小苗。尽管这些小苗可移至大田并很易成活，但手工移栽小苗至大田中是一项费力的劳动。在生物反应器中生产小球茎是相当困难的，幸运的是，我们发现了在生物反应器内诱导小球茎形成的特殊条件，即是将蔗糖浓度提升到90克／升，及使培养基逐渐脱水的方法。在一个8升的生物反应器中，加入6升培养基，接种幼苗培养一个月，添加蔗糖使其终浓度达到90克／升，同时，加大通气速率，使培养基在下一个月期间逐渐脱水，此期，培养物呈现出明显的形态学变化，并在芽的底部附近形成2977个小球茎，将移栽这些小球茎至大田是很容易的。
马铃薯：马铃薯小块茎是最主要的马铃薯繁殖手段，这是因为其易储存，容易运输和经销。在琼脂培养基上组培生产马铃薯小块茎已有许多研究和报道。本文作者已建立了多种用生物反应器大规模的生产繁殖马铃薯小块茎的技术。其中最有效的方法是不完全连续的液体培养基表面控制法(图2A略)。
从种球上取下的无毒幼苗通过继代培养建立起芽无性系，然后将之转入含有少量液体培养基，30克／升蔗糖的生物反应器中，10升生物反应器中装有1升培养基，培养基水平面较低，培养期间，连续光照(2.5W／M2)四周后，芽在生物反应器内的空间中充分生长，之后，换用8000亳升含90克／升蔗糖的液体培养基，用不完全连续液体培养基表面控制法，在25℃和稍暗的光线(0.9W-2)条件下连续培养6周，马铃薯小块茎于是在有充分生长空间的生物反应器中被诱导产生(图2B略)，移植和栽培在生物发生器中培养的马铃薯小块茎的条件也已做过仔细的研究(1993)。图3A、B：在两种50升生物反应器中培养基的流动特性。A简单的通气：①在两个生物反应器的中心培养基液面下10厘米处装有一个电磁流速仪，用来测定培养基的流速，在Y轴的“+”、“-”符号代表培养基的流动方向；②通气率为20升／分钟。
五、在大型的生物反应器中大规模繁殖植物
本作者是最初报道用生物反应器进行植物组培苗繁殖生产的。繁殖的植物材料为秋海棠，它采用气体作为驱动力(简易通气和气泡柱)，对在生物反应器内大规模繁殖秋海棠时所遇到的问题作了仔细研究。秋海棠在一个2升的气泡柱生物反应器内的生长量(终干重／初干重比是19.8和21.6)，较摇动着的烧杯中生长量低(终／初干重比是47.1)，且在10升的生物反应器中，(即在实验中被称为大发酵坛的)，其终／初干重比下降到8.3，产生这种下降的原因是气泡产生的剧烈切应力。这会导致生物反应器内培养基流动速率的不同(见图3A)在生物反应器里的液体培养基的流动速率和方向波动很大，这种波动可在采用多孔的喷嘴式气升生物反应器内极大地降低(见图3B)这些结果显示出在大规模繁殖时，生物反应器的基本设计和结构的重要性。
大规模繁殖时，另一个重要的条件为接种物的准备和接种方法。用来接种的组织片段可以是嫩枝(stevia
rehaudiana颠茄、马铃薯等)，不定芽(秋海棠Duboisia
myopoloides透骨草、风信子、唐菖蒲、安祖花、半夏、Stevia
rehaudiana)；腋芽(草莓)。在生物反应器中，较小的组织片段含较多的芽有利于大规模繁殖。图3B：说明同图3A，B为气升的生物反应器。
六、大规模繁殖的新技术和方法
一个研究实例：在充气搅动的生物反应器中的繁殖组培苗。大规模繁殖组培苗时所遇到的问题是通气和摇动所产生的巨大剪切应力对生长和再生所产生的抑制。为在大型生物反应器中大规模繁殖组培苗，需发展一个突破性的技术来刺激小植株的再生或抑制切应力对植物生长的影响。直到现在，切应力对植物生长的影响还未被充分了解。大型生物反应器使充气摇菌生物反应器的使用受到限制，作者正试图建立一种在很高的切应力下的再生系统。且已建立了采用毛根(胚根)培养颠茄诱导产生不定芽。在这一研究中，颠茄受到浓杆菌MAFF301724侵染后产生了毛根，在诱导的毛根培养物中，选择出一种毛根培养品系可以忍受较多的切应力，且在
无植物激素的30克／升蔗糖的B5培养基中生长良好。装培养基的容器为带有挡板的烧杯或为一个带有涡轮推进器的通气搅动生物反应器。当毛根培养物被转入无植物激素的含10克／升蔗糖的MS培养基中后，则可再生出许多分离的不定芽。(尺寸为5到10mm)，每个培养烧杯中的不定芽数量都显著地增多。不定芽的数量增多的原因可能是外力搅动培养基而破坏了原先的培养物，从而导致一系列不定芽的再生。这些结果显示不定芽的再生不再被较高的切应力抑制，在切应力下长出的不定芽，可以很容易地生长在MS琼脂培养基上。